معرفی میکروسکوپ نانولایو

1-مقدمه
تمامی اطلاعاتی که توسط میکروسکوپهای نوری معمولی به نمایش گذاشته میشود، میانگینی ) Ensemble average ( از وقایع
چندین سلول است. به همین دلیل هیچگاه نمیتوان با قاطعیت پیرامون برهمکنش یک اندامک با یک بخش دیگر )در درون همان
سلول( صحبتی به میان آورد. در حقیقت، پیشبینی دقیق رفتار یک سلول نیازمند آگاهی دقیق از اجزای درون سلولی و نیز
تصویربرداری در حد تک مولکول است. میکروسکوپهای نوری معمولی توانایی لازم جهت به نمایش گذاشتن این حد از رزولوشن را
دارا نیستند. لذا کاربرد چنین میکروسکوپهای برای بررسی و تصویربرداری در سطح تک مولکول یا به عبارتی پیشبینیهای دقیق
در علوم زیستی با محدودیتهای اساسی روبرو گشته است. در این دوره ضمن معرفی تاریخچهای از میکروسکوپهای نوری معمولی،
معین خواهد شد که به چه دلیل، نمیتوان از از میکروسکوپهای نوری جهت تصویربرداری در حد تک مولکول بهره گرفت. در ادامه
این دوره برخی از مهمترین میکروسکوپهای سوپر رزولوشن نوری معرفی خواهد شد که توانسته اند بر اکثر محدودیتهای
میکروسکوپهای نوری معمولی غلبه نمایند اما باز هم به دلیل بکارگیری پروبهای فوتوسوئیچبل از کارایی لازم برای بررسی بدون
سیمت نوری و بدون نیاز به برچسبهای فلورسانس برخوردار نیستند. در پایان این دروه به معرفی دسته بسیار جدیدی از
میکروسکوپهای نوری ) Nanolive ( پرداخته میشود که عاری از هر گونه برچسب فلورسانس ) Label-Free ( بوده، میتوانند
بدون هیچ محدودیت زمانی و سمیت نوری ) Photo-Toxicity ( از تمام وقایع درون سلولی به صورت زنده ) Live ( تصویربرداری
کنند.
2 ) میکروسکوپ های نوری معمولی
میکروسکوپهای نوری از قرن هفدهم زمانی که آنتونی ون لوونهوک و روبرت هوک، مشاهدات خود را با استفاده از میکروسکوپهای
تک لنز و ترکیبی گزارش نمودند، نقش مهمی در کمک به کشف رمز و رازهای پیچیده زیستشناسی ایفا کردهاند. پیشرفتهای
فناوری اخیر منجر به طراحی میکروسکوپ بسیار پیشرفتهی نوری گردیده است و رزولوشن تصاویر به طرز چشمگیری بهبود یافته
است. اما با وجود طراحی و ساخت لنزهای مدرن، میکروسکوپهای مبتنی بر لنزهای شیشهای با محدودیت نهایی در رزولوشن خود
)که بخشی از آن ناشی از ماهیت موجی امواج مورد استفاده و بخشی بخاطر جنس لنزها است(، مواجه هستند. محدودیت موجی
بودن که به “محدودیت پراش 1Abbe ” معروف است موجب میگردد تا در بهترین حالت رزولوشن در راستای جانبی 200 نانومتر
و در راستای محوری 500 نانومتر باشد )شکل 1 .)

مطابق محدودیت Abbe ، محدودیت در راستای جانبی از رابطه 𝑑𝑥−𝑦=𝜆2 𝑁𝐴 و محدودیت برای راستای محوری از رابطه 𝑑𝑧=2 𝜆 𝑁𝐴2 محاسبه میگردد.

شکل 2 . راستای محوری و جانبی

دیافراگم عددی ) 2NA ) که نشان دهنده توانایی یک لنز در جمع آوری اطلاعات از محیط پیرامون است نیز مطابق روابط ذکر شده
در رزولوشن نهایی تصویر تاثیر میگذارد. این توانایی بستگی به ضریب شکست میان نمونه و سطح لنز و همچنین زاویه روزنه لنز با
سطح نمونه ) 𝜃 ( نیز دارد ) 𝑁𝐴=𝑛sin𝜃 (. مطابق شکل 3 برای لنزی که دارای زاویه 72 درجه، مقدار دیافراگم عددی 95 / 0
محاسبه شده است که نسبت به لنز با زاویه 30 درجه رزولوشن بهتری را نمایش خواهد داد.

از سوی دیگر ضریب شکست نیز در مقدار دیافراگم عددی تاثیر میگذارد )شکل 4 (. هر چه که میزان ضریب شکست بالاتر باشد،
میتوان انتظار داشت که تعداد پرتوهای بیشتری پس از عبور از نمونه میتوانند وارد لنز گشته و در نتیجه رزولوشن بالاتری به دست
آید.

مطابق شکل 4 – ب به دلیل استفاده از غوطهوری روغن میان عدسی و سطح نمونه ) Oil immersion ( میزان ضریب شکست
افزایش پیدا کرده و سبب میگردد تا پرتوهای شمارههای 3 ، 4 و 5 )شکل 4 – الف( بتوانند وارد لنز گشته و در نتیجه رزولوشن
بالاتری به دست آید.
مشکلات پیش روی لنزها از جمله ابیراهی نوری و کروی نیز موجب میگردند تا رزولوشن تصاویر به دست آمده کاهش یابد )شکل
5 (. در ابیراهی نوری از آنجایی که ضریب شکست لنز برای هر یک از طول موجهای نور مرئی )بنفش، نیلی، آبی، سبز، زرد، نارنجی
و قرمز( متفاوت است، هر یک از طول موجها پس از عبور از عدسی، به جای متمرکز شدن در یک نقطه در بخشهای مختلف متمرکز
گردد که نهایتا موجب میشود تا رزولوشن تصویر کاهش یابد. سطح ناصاف لنزها در ابیراهی کروی نیز موجب میشود تا متمرکز
شدن در بخشهای مختلف حتی برای یک طول موج روی دهد که خود عاملی بر کاهش رزولوشن خواهد بود. از سوی دیگر به هنگام
دریافت اطلاعات، بخشی از اطلاعات تصویر از میان میرود. به عنوان مثال در میکروسکوپهای فلورسانس به دلیل شیفت قرمز نور
گسیل شده نسبت به طول موج تهییج مورد استفاده، بخشی از اطلاعات از بین میرود که خود سبب کاهش میزان رزولوشن خواهد
شد.

خاصیت موجی نور موجب میشود تا نور پس از عبور از نمونه در فضای دوبعدی دیسکهای Airy و در فضای سه بعدی تابع نقطه
گستر ) 3PSF ( را تشکیل دهد )شکل 6 (. تمام تلاش محققان این است که بتوانند به صورت فیزیکی عرض پیک در نصف ماکزیمم
شدت PSF را کاهش دهند تا بتوانند رزولوشن تصاویر را افزایش دهند.

3 ) میکروسکوپهای نوری سوپر رزولوشن
دانشمندان برای مقابله و غلبه بر محدودیتهای ذکر شده برای میکروسکوپهای نوری معمولی، میکروسکوپهای سوپر رزولوشن را
معرفی کردهاند. انواع مختلف از این میکروسکوپیها وجود دارند که در این بخش به معرفی تعدادی از آنها پرداخته میشود. در این
میکروسکوپها اندازه PSF به صورت فیزیکی کاهش مییابد. به عنوان مثال در میکروسکوپهای 4Pi که از دو لنز همزمان برای
تابش دهی و دریافت اطلاعات استفاده میگردد، چون میزان اطلاعات از دست رفته کاهش مییابد، لذا میزان رزولوشن این
میکروسکوپ برای راستای محوری نسبت به انواع میکروسکوپهای کانفکوکال افزایش خواهد یافت )شکل 7 .)

در برخی دیگر از میکروسکوپهای سوپررزولوشن از نشر القایی ) Stimulated Emission ( جهت کاهش دادن اندازه PSF بهره
گرفته شده است. در میکروسکوپ 4STED در ابتدا با استفاده از یک لیزر تمامی یک ناحیه همچون میکروسکوپهای فلورسانس
معمولی تهییج )توسط Excitation Laser ( میشود. سپس تمامی ناحیه تهییج شده بجز قسمت مد نظر که در بخش مرکزی
ناحیه تهییج شده قرار گرفته است، توسط لیزر تهی سازی ) Depletion Laser ( مجبور به گسیل نور )یا همان از دست دادن نور(
طی فرایند نشر القایی میشوند. مطابق شکل 8 پس از گذشت مدت زمانی معینی، بخش مرکزی )که لیزر تهی سازی به آن برخورد
نکرده است( دچار نشر خود بخودی ) Spontaneous Emission ( میگردد و سبب میشود تا رزولوشن تصویر به 50 نانومتر برسد.

در برخی دیگر از میکروسکوپهای سوپررزولوشن مانند 5STORM که از پروپهای فوتوسوئیچبل استفاده میکنند، میتوان با
استفاده از روشن و خاموش کردن چندین مرتبهای این چنین پروبهای موقعیت بخشهای مختلف را به صورت متوالی تعیین کرد.
علیرغم کاهش رزولوشن راستای محوری در مقایسه با راستای جانبی توسط میکروسکوپهای سوپر رزولوشن، به دلیل کارائی پایین
این پروبها در روشن و خاموش شدن متوالی و نیز درخشندگی پایین برخی از این پروبها، محدودیتهایی برای این میکروسوپها
برای مشاهده وقایع زیستی در نظر گرفته شده است )جدول 1 .)

4 ) میکروسکوپ نوری روبشی میدان نزدیک
دسته ی جدیدی از میکروسکوپهای پروب روبشی ) 6SPM ( که پس از میکروسکوپهای الکترونی وارد عرصه تصویربرداری شده
اند، میکروسکوپهای نوری روبشی میدان نزدیک ) 7SNOM ( نام دارند. این میکروسکوپ نوری از یک پروب به عنوان فیبر نوری
جهت تابشدهی و همچنین دریافت اطلاعات از یک سطح بهره میبرد. از آنجایی که فاصله میان نوکه تیز پروب این میکروسکوپ و
نمونه کمتر از طول موج نور فروردی است، بیان میشود که این میکروسکوپ اطلاعات میدان نزدیک ) Near-Field ( را سنجش و
دریافت میکند. علیرغم اینکه میکروسکوپ نوری روبشی میدان نزدیک نیازمند استفاده از لنز و نیز پروبهای فلورسانس برای
تصویربرداری نیستند و اطلاعات میدان نزدیک )که در میدان دور قابل دسترسی نیست( را میتواند نشان دهند، اما این میکروسکوپها
تنها میتوانند اطلاعات سطحی از محیط به نمایش بگذارند و لذا برای بررسی اطلاعات و وقایع درون سلولی کارا نخواهد بود )شکل 9 .)
5 Stochastic Optical Reconstruction Microscope
6 Scanning Probe Microscopy
7 Scanning Near-Field Optical Microscopy

5 ) میکروسکوپ نانولایو
دسته جدیدی از میکروسکوپهای نوری که بدون هیچگونه محدودیت )که در میکروسکوپهای نوری معمولی، سوپررزولوشن و نیز
SNOM دیده میشود( میتوانند وقایع درون سلولی را به صورت زنده، عاری از هر گونه برچسب فلورسانس ) Label-Free ( برای
مدت زمان طولانی و بدون هیچگونه سمیت نوری ) Photo-Toxicity ( به نمایش بگذارند، اختراع شده است. این میکروسکوپها
که تحت عنوان میکروسکوپهای نانولایو ) Nanolive ( شناخته شدهاند، میتوانند بر اساس نقشه ضریب شکست ) 8RI ( تصاویر سه
بعدی از وقایع درون سلولی نمایش دهند. به عنوان مثال از آنجایی که ضریب شکست کروماتین نسبت به غشای هسته متفاوت است
میتوان با اختصاص دادن یک رنگ دیجیتال به هر ضریب شکست، بخش مد نظر که در این مثال کروماتینهای داخل هسته است
را رنگ آمیزی دیجیتال ) Digital Staining ( کرد. برای رنگ آمیزی دیجیتال از نرم افزار STEVE بهره گرفته میشود. همچنین
این میکروسکوپ به دلیل دارا بودن انکوباتور کوچک، میتواند بدون وقفه از وقایع درون سلولی فیلمبرداری نماید )شکل 10 .)

سه دسته از این میکروسکوپها در حال حاضر معرفی شده اند )شکل 11 (. میکروسکوپهای دسته اول ) The 3D Cell Explorer )
تنها از نقشه برداری دیجیتال برای نمایش دادن اطلاعات بهره میبرند. دسته دوم از این میکروسکوپها ) 3D Cell Explorer-

fluo ( قابلیتهای میکروسکوپهای فلورسانس را با قابلیتهای میکروسکوپهای دسته اول ترکیب کرده و میتوانند کولوکالیزاسیون
را به نمایش بگذارند. دسته سوم این میکروسکوپها ) CX-A ( نیز میتواند به کاربر اجازه دهد تا وقایع درون سلولی را برای هر
چاهک پلیتهای 96 خانه مشاهده نماید.

این میکروسکوپها برای تمام علوم پزشکی، زیستشناسی و همچنین دنیای نانوفناوری )جهت مشاهده نانوذرات و تاثیرات مختلف
آنها بر سلولهای زنده( کاربردهای گوناگونی را به نمایش گذاشتهاند که در شکل 12 قابل مشاهده است.

6 ) یاداشت پایانی
در دوره پیش روی شما، ضمن معرفی مزایا و محدودیتهای هر یک از میکروسکوپهای نوری که تاکنون توسط بشر به خدمت
گرفته شده است، شما شرکت کننده گرامی میتوانید با اساس عملکردی میکروسکوپهای نانولایو آشنا شده و با ویدئوهای اختصاصی
ارائه شده برای هر یک از کاربردهای نشان داده شده در شکل 12 آشنا شوید. در انتهای این دوره نیز شما شرکت کننده گرامی
میتوانید نحوه کار با نرم افزار STEVE را بیاموزید.

7 ( منابع مورد استفاده
https://www.nanolive.ch/
https://www.microscopyu.com/
https://www.zeiss.com/microscopy/int/home.html

با آرزوی سلامتی و بهروزی برای شما شرکت کننده گرامی
دکتر هادی سردارآبادی